辛伐他汀对大鼠颅脑外伤后弥漫性轴索损伤的实验研究

CHINESEJOURNALOFINTEGRATIVEMEDICINEONCARDIO/CEREBROVASCULARDISEASE December 2016 Vol.14 No.23

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(收稿日期:2016

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辛伐他汀对大鼠颅脑外伤后

弥漫性轴索损伤的实验研究

史立信1,胡福广2,徐兆冰3,吴景春1,张文超1,王传海1

目的 观察辛伐他汀对大鼠颅脑外伤后弥漫性轴索损伤的治疗效果。方法 用加速减速装置制作大鼠弥漫性轴索损 摘要:

伤(DAI)模型,分为安慰剂组与辛伐他汀组,口服生理盐水与辛伐他汀14d,另选健康SD大鼠作为对照组。以经修改神经功能损伤程度评分(mNSS)来测定神经功能恢复状态;以淀粉样β阳性前体蛋白(APP)单克隆抗体进行免疫组化实验以测定轴索损伤程度,

以Bielshowshy银染法测定神经轴索密度。结果 与安慰剂组及对照组比较,辛伐他汀组mNSS评分明显降低,差异有统计学意义mNSS评分与神经轴索密度呈明显负相关。结论 辛伐他汀能促进颅脑外伤后弥漫性周索损伤中神经轴索损伤的修复与增长。

(;;P<0.05)辛伐他汀组APP阳性神经轴索密度明显降低,而银染阳性神经轴索密度明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)弥漫性轴索损伤;颅脑外伤;辛伐他汀;免疫组化;淀粉样β阳性前体蛋白 关键词:

:/()doi 中图分类号:R651.1 R285.5 文献标识码:A 10.3969.issn.1672-1349.2016.23.014 文章编号:1672-1349201623-2766-04jEfficacyofSimvastatinonDiffuseAxonalInjuryafterCranialInjuryinRats

ShiLixin,HuFuguang,XuZhaobing,WuJingchun,ZhangWenchao,WangChuanhaiPeople’sHospitalofQinghe,Qinghe054800,Hebei,ChinaCorrespondingAuthor:ShiLixin

;作者单位:1.河北省清河县人民医院(河北清河054800)2.河北医科大学第二医院;3.山东省聊城市第二人民医院

通讯作者:史立信,Email:wbslx8099@163.com

:引用信息:史立信,胡福广,徐兆冰,等.辛伐他汀对大鼠颅脑外伤后弥漫性轴索损伤的实验研究[J].中西医结合心脑血管病杂志,2016,14(23)2766

2768.

中西医结合心脑血管病杂志2016年12月第14卷第23期·2767·

(TBI)inrats.Methods AdulthealthySpragueDawley(SD)ratsDAImodelsafterbraininjurywasmadebyacceleratinganddecel-eratingapparatus,whichwerethendividedbytwogroups.Salineandsimvastatinwasadministratedfor14days.Amodifiedneurologi-calseverityscores(mNSS)testwasperformedtoevaluatedegreeofneuralfunctionalrecovery.Immunohistochemistrystudieswithamyloidβprecursorprotein(APP)wasperformedtomarktheaxonalinjury,andBielshowshy`ssilverdyingwasprocessedtoeval-uatetheaxondensity.Results SymvastatindecreasedthemNSSscoreinthesimvastatingroup.ThedensityofAPPpositiveneuralaxonsdecreasedobviouslyinthesimvastatingoup,withwhichofsilverpostiveaxonselevatedinit.ThemNSSscorewasnegativelypromoteaxonalregenerationinDAIafterTBI.

correlatedwiththedensityofneuralaxonsthroughPearsoncorrelationanalysis.Conclusion SimvastatincanrepairaxonalinjuryandKeywords:diffuseaxonalinjury;traumaticbraininjury;simvastatin;immunohistochemistry;amyloidβprecursorprotein

Abstract:Objective Toobservetheeffectofsimvastatinonthetreatmentofdiffuseaxonalinjury(DAI)aftertraumaticbraininjury

弥漫性轴索损伤(

diffuseaxonalinjury,DAI)是颅脑外伤的常见伴发疾病也是颅脑外伤后重要的致残原

因[1]有重要的作用,神经轴索损伤和恢复及颅脑外伤后功,目前关于DAI这一病理过程的基础和

能康复具

临床研究[

2]

具有多重作用。辛伐他汀被多项研究证实在颅脑外伤中[34]

脑外伤后弥漫性,轴本研究通过动物实验分析该药在颅

索损伤中的药物作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1雄各 DAI模型建立半,体重250 选取健康成年SD大鼠40只,雌(g0.2mL/100g~0.4mL/100~360g,用4%水合氯醛麻醉

g)后,以西安交通大学医学院刘晓斌医师瞬间加减速损伤装置制作DAI模

型[5]其尚处于激烈挣扎间歇期按动实验装置扳机:将已麻醉大鼠固定于旋转装置上,麻醉苏醒后在

,颅瞬间旋转90DAI模型大鼠随机°

,使其头并记录大鼠生命体征及行为改变分为实验组和安慰剂组(生理盐,把水组),各20只,另选20只SD大鼠作为健康对照组并正常饲养。安慰剂组SD大鼠给予生理盐水口服持续14d;实验组SD大鼠给予辛伐他汀1mg/(kg·d),连续14d。3组大鼠于实验第15d分别以4%水合氯醛麻醉,依次经心脏灌注生理盐水及4%多聚甲醛至四肢抽搐、肺及肝脏变白,而后迅速解剖分离全脑,以4%多聚甲醛固定48h,然后以冠状位等厚度分为7块取材,再脱水、透明、浸蜡及包埋处理。

1.2阳性前体蛋白 免疫组织化学及银染色检查(

βprecursor 本实验以淀粉样

amyloidprotein,APP)单克隆抗体标记发生损伤的神经轴索

[6]

shy银染色以显示神经轴索。对于处理过的脑组织以

,并用Bielshow-生物组织切片机以5μm厚度连续切片,脱蜡,水化,

然后3%H2O2处理以阻断内源性过氧化物酶活性,将切片置于盛有1%柠檬酸溶液的高压锅中煮沸10min以修复抗原,之后向组织切片上滴加1一抗4℃孵育过夜,再滴加偶联有生物素的二抗

∶500的抗APP室温下反应2h,最后以DAB在光镜下显色。为了显示神经轴索形态,对脑组织切片进行Bielshowshy银染色:先把组织切片置于20%银中孵育,之后在氨水中返蓝。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行分

析,计量资料以均数±标准差(xKeuls(±s)表示,组间比较采用Student

Newman

SNK)统计学方法,轴

索密度与神经功能评分间关系采用Pearson相关性分析法,以P<0.05为差异有统计学意义。22.1 结 辛伐他汀对 果

DAI后大鼠神经病学行为的影响采用mNSS损伤评分来测定SD大鼠加速减速

致DAI后的神经病学行为改变,在DAI后第1天mNSS评分11分,从伤后第3天神经功能即开始恢复至第14天;与安慰剂组比较,治疗组辛伐他汀能明显降低mNSS评分(第7天:辛伐他汀组6.3分±0.5分vs安慰组8.4分±0.6分;P=0.012;第14天:辛代他汀组4.8分0.007)

±0.4分vs安慰剂组7.6分。±0.6分,P。详见图1=图12.2 辛伐他汀 3组大鼠神经功能损伤mNSS评分变化

对轴索损伤的影响 比较辛伐他汀对

轴索损伤药物作用,对DAI安慰剂组和辛伐他汀组大鼠脑组组进行淀粉样cursorprotein,APP)免β阳性前体蛋白(amyloid疫组化及Bielshowshyβpre银染-色。结果:辛伐他汀明显降低APP阳性损伤轴索密度,差异有统计学意义(P明显升高Bielshowshy银染=0.014);并发现辛伐他汀阳性轴索密度,且差异有

β·2768·

CHINESEJOURNALOFINTEGRATIVEMEDICINEONCARDIO/CEREBROVASCULARDISEASE December 2016 Vol.14 No.23

。详见图2。统计学意义(P=0.021)

注:A、D为对照组;B、E为安慰剂组组;C、F为辛伐他汀组。(图A

2.3 DAI后大鼠轴索数量与神经病学行为关系 对DAI第14天mNSS评分与银染所示轴索密度进行Pearson相关性分析,结果:mNSS评分与轴索密度明显负相关,相关系数r=-0.96,P=0.006。详见图3。

图2 3组大鼠APPIHC染色与Bieschowshy银染示轴索密度变化

C为IHC染色,图D×400倍;F为Bieschowshy银染色,×400倍)

通过瞬间加减速损伤装置制作大鼠脑外伤后弥

漫性轴索损伤模型,该模型具有颅脑外伤后DAI多项

18]

。实验性颅脑外伤后特征,故可用于DAI实验研究[

1h内大鼠即出现轴索损伤,在随后数小时内轴索损伤范围不断扩大,在损伤后80h便出现大量轴索肿

19]

。轴索损伤不断加重可产生一系列病理生理学胀[

改变:钙离子内流、神经纤维骨架解体、神经轴索细胞膜破裂及最后轴索不可逆的断裂,因此理论上可通过

20]

。本阻止该过程的某些环节而起到治疗DAI作用[

实验选用APP单克隆抗体以免疫组化方法和

Bielshowshy银染显示受损的神经轴索,实验结果显示神经轴索损伤的形态改变有:轴索增粗、串珠状及球

3 讨 论

DAI约占重型颅脑损伤28%~42%,死亡病人中占29%~43%,病情危重,病死率和致残率高,是导致颅脑损伤病人神经功能障碍、植物状态和死亡的主要

79]

。既往对DAI治疗缺乏特异性手段,原因[随着对其

图3 轴索数量与mNSS评分相关性分析

状改变。

有研究报道:当与其他相关药物合用时辛伐他汀

21]

,可减轻脑血栓后神经轴索的损伤[本实验验证辛伐

他汀单药对神经轴索的作用,辛伐他汀是脂溶性药物,比其他水溶性他汀类药物更易通过血脑屏障。本实验结果显示辛伐他汀明显减少APP阳性损伤轴索密度,提示该药能减轻颅脑外伤后弥漫性轴索损伤。辛伐他汀治疗后第14天,与对照组和安慰剂组比较,Bielshowshy银阳性神经轴索密度明显增高,该结果与神经行为缺损mNSS评分相一致。但需要大样本实验以进一步验证这种相关性。

本实验辛伐他汀治疗后轴索数量的增加或许是轴索损伤的减轻和(或)颅脑外伤后轴索再生增强的结果。由于实验条件所限,没有进行进一步实验以明确

22]

其中机制,但DiGiovanni[对体外培养的PCN细胞

病理生理学机制研究不断深入,一些针对DAI病变进程的药物不断地得到动物实验验证,并有些已应用于

1015]

,临床中[但是关于降脂药辛伐他汀在DAI治疗作

用的基础研究还未见报道,所以本研究通过动物实验探讨辛伐他汀对DAI的药物作用。

他汀类药物是3羟基3甲基戊二酸单酰辅酶A(3

hydroxy

3

methylglutarylcoenzymeA,HMG

CoA)还原酶抑制剂,具有抗炎、抗氧化作用、免疫抑制、改善内皮功能,减轻炎症反应和再灌注损伤,有助于保持病理情况下血脑屏障的完整性和星型胶质细胞的功能,减少神经元的继发性损害。辛伐他汀可明显抑制颅脑损伤后Caspase

1617]

。发挥神经保护作用[

株施以辛伐他汀后发现受损的神经轴索很快修复增长,并且这种作用能被LY29402抑制而能被LiCL增强,认为辛伐他汀的促轴索生长作用是通过PI

3k路

径实现。有实验研究表明,单纯地移除抑制性因子不

23]

,足以使神经轴索成功再生[而另有实验证据提示活

3的表达,阻碍其活化,阻

滞由其介导的蛋白酶级联反应导致的细胞凋亡过程,

中西医结合心脑血管病杂志2016年12月第14卷第23期

24]

,化内源性途径或许能实现神经轴索的增生[Park

·2769·

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66receptorantago-

25]

等[发现mTOR就是其中一种调节内源性调节蛋白,

这种蛋白质在神经元发育过程中非常活跃,而在成熟神经元中活性较低;若将损伤的视神经元mTOR路径负性调节因子PTEN基因删除,则会观察到轴索迅速增长,由于mTOR是PI有可能是通过激活PI

3K/Ak路径下游靶向分子,结3K/Ak路径实现。

合本实验结果,推测辛伐他汀之所以能增加轴索密度,

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