多肽类药物有关物质研究的探讨

天津药学　Ｉ　肌ｊｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｙ　２０１３年第２５卷第１期　９　成分受热后苷键断裂，导致糖类成分的产生；也有可能　参考文献　某些生产企业利用添加葡萄糖来调节注射液的渗透压　１于清萍，宁营．银杏叶提取物的研究进展及市场概况［Ｊ］．上海医药，　而导致注射液中葡萄糖含量的提高。过量的５一羟甲　２０１０，３１（８）：３４２　２谭俊杰，柴建国，张善飞，等．参麦注射液中５一羟甲基糠醛含量的高　基糠醛会对人体产生毒性，因此在含葡萄糖或可以降　效液相色谱测定［Ｊ］．时珍国医国药，２０１１，２１（７）：１６２４　解成葡萄糖的中成药注射液中，５一羟甲基糠醛应作为　３徐世霞．ＨＰＬＣ法测定生脉注射液中５一羟甲基糠醛的含量［Ｊ］．中　一个重要的有关物质加以控制，确保中成药注射液的　国民族民间医药，２０１１，２０（１４）：３６　用药安全。　４张科卫，吴皓．小半夏汤中５一羟甲基糠醛的含量测定［Ｊ］．中国实　３．２本文建立了ＨＰＬＣ法测定舒血宁注射液中５一羟　验方剂学杂志，２０１０，１６（１３）：５１　５孙文，巢志茂，王淳，等．ＨＰＬＣ对市售瓜蒌中５一羟甲基糠醛的含量　甲基糠醛含量的方法，供试品无需前处理，快速简便，　测定［Ｊ］．中国实验方剂学杂志，２０１２，１８（１８）：７３　准确可靠，为舒血宁注射液的质量控制提供了依据。　多肽类药物有关物质研究的探讨　白海娇　，王亚敏　，丁一　（１．天津市药品检验所，天津３０００７０；２．中国药品审评中心，北京１０００３８；３．天津药物研究院，天津３００１９３）　摘要多肽类药物一般需要通过注射给药，有关物质检查是控制药品安全性的重要指标。由于多肽类药物的自身　特点，如何进行多肽药物的有关物质研究是一个很值得探讨的问题。笔者结合多肽药物的特性和自身工作实践，总结了　多肽药物有关物质研究中常见的问题，并提出了自己的见解。　关键词　多肽药物，有关物质研究　中图分类号：Ｒ９２７．１１　文献标识码：Ａ　文章编号：１００６—５６８７【２０１３）０１４）００９－０３　近年来，多肽类药物成为药物研发的热点，申报的　的杂质，难于与主成分完全分离，而且也无法观察主要　多肽类新药也逐渐增多，这类新药与普通的化学药品　杂质的变化情况和影响稳定性的主要因素。关于多肽　相比，结构复杂、稳定性差，生产工艺和质量标准等方　类药物如何进行有关物质方法学验证，目前没有共识　面均有所不同。　的方法，由于经验有限，这里仅提一点笔者不成熟的意　有关物质检查是控制药品安全性的重要措施。目　见。　前，多肽类药物多采用生化提取、转基因技术和固相合　对多肽进行常规强制降解试验不可取的原因是：　成工艺制备，其工艺特点决定了产物的杂质含量较高。　在实际生产、贮存条件下，主成分不会发生如此强烈的　同时多肽药物具有以下特点：①稳定性差，化学和构象　降解，因此试验结果不理想不能彻底否定检测方法的　不稳定性；②易被胃肠道中的蛋白质水解酶降解；③体　可行性。引起多肽药物不稳定的原因主要有水解、氧　内生物半衰期短，消除或降解迅速；④脂溶性差，不易　化、外消旋化、二硫键的断裂及重排、Ｂ消除、凝聚、沉　通过生物屏障等。因此，多肽药物通常选择注射途径　淀和吸附等。多肽类药物杂质检测的方法学验证，首　给药　Ｊ，其有关物质检测更值得关注。　先应考虑合成中可能产生的中间体、同系物和错肽等　普通化学药物多采用ＨＰＬＣ、ＴＬＣ等方法检测有关　副产物是否可与主成分分离，并有效检出。可以采用　物质¨Ｊ，在方法学验证时通常对药品进行强酸、强碱、　粗品进样分析，中间体可采用外加的方法考查分离情　光、热和氧化破坏，考查降解产物是否能与主峰（或斑　况。’对于运输、贮藏中产生、增加的杂质，可以采用适　点）分离　Ｊ，而这种强制降解试验在多肽类药物的有关　当改变药品的处方和贮藏条件的方法考查，例如采用　物质方法学研究中是不十分适用的。由于多肽类药物　改变酸碱度、贮藏条件的光照强度、少加或不加抗氧　很不稳定，对于酸、碱、光、热等因素和微生物、金属离　剂、提高贮藏温度、摇床振动、反复冻融等方法，加速多　子、运输过程中的振动等因素均比较敏感，因此在剧烈　肽降解。当然由于考查条件比较温和，可以适当延长　的破坏条件下，主成分基本全部被破坏，不仅产生过多　考查时间，这样即可以考查杂质检测方法的可行性，也　收稿日期：２０１２４）９－２９　１０　天津药学Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｙ　２０１３年第２５卷第１期　可以对制剂的处方选择和贮藏条件的选择提供一定的　帮助。　一般不建议采用薄层色谱控制杂质。　有关物质检测方法是否能比较全面地检出杂质，　在这类药物的杂质考查时，应该有针对性的着重　并且能反映药物质量变化，物料平衡应该是重要的考　考查几种检测难度较大、对药物安全性有重要影响的　量因素。无论是在稳定性研究中，还是在上述有关物　杂质。多肽的聚合物是影响药物安全性的重要因素之　质的方法学研究试验中，含量的降低应该在杂质检测　由半胱氨酸的巯基形成的二硫键是形成二聚体、三　中有相应的反映。但两者存在多大差距，就认为杂质　一，聚体的主要共价键，对于含有一个半胱氨酸的多肽一　检测不适用，这个问题尚没有一个明确的限度。笔者　定应考虑二聚体检测，含有两个半胱氨酸的就应该考　认为如果含量下降超过２％，并且两者差距超过１％，　虑三聚体甚至多聚体的检测了。由于多肽合成、提取　就值得进一步研究。在审评中经常见到在影响因素和　过程中多存在变性和复性的情况，存储过程中也会有　少量多肽变性聚合，因此检测高分子量物质是非常必　要的。通常采用高效分子排阻色谱法（ＨＰＳＥＣ）以亲水　硅胶、凝胶为填充剂，对于已知的二聚体、三聚体应采　用外标法或相对保留时间方法确定峰位。对于已知结　构的大分子多肽，主峰前的杂质峰均可按高分子物质　计算，但对于生化提取的多肽类制剂，由于成分复杂，　结构不确定，多采用胰岛素等已知分子量的蛋白为参　比物质，只检测分子量大于该蛋白的高分子物质，有时　还要配合沉淀法，定性检测蛋白质。　对于合成多肽，其旋光异构体也是值得注意的问　题，虽然，很多人认为固相合成极少发生外消旋化，但　相关研究表明，消旋异构体还是存在的＿３］。例如有资　料表明肠降血糖素类似物艾塞那肽，采用ＳＣＸ—ＨＰＬＣ　检查早期批次产品的纯度仅８８．０％，其中杂质［Ｎ—　Ｈｉｓ　］高达９．８％。因此至少在早期的有关物质研究　中，应对消旋异构体进行充分的研究。　值得指出的是，目前国内多肽药物在进行杂质检　测时多采用一种色谱系统，使用最多的是反相ＨＰＬＣ，　ｃ　色谱柱，等度洗脱。事实上，由于反相ＨＰＬＣ主要是　利用待检物质在固定相和流动相中分配系数不同的原　理，因此一般在等度洗脱条件下，能检出的杂质是非常　有限的，极性大的物质没有保留，极性过低的物质又没　有洗脱出来，因此一般降解产物复杂的多肽类药物应　采用梯度洗脱方式检测＿４ｊ。多是先采用高水相的流动　相洗脱，以利于主峰与类似物峰的分离，然后梯度洗脱　增加有机相比例，将水溶性差的聚合物和错肽洗出。　但国内常采用的纯水相与纯有机相在线梯度混合的洗　脱方式是不可取的，特别是对于水相含盐量较高的流　动相，由于色谱系统不稳定，容易造成杂质高估或　低估。　同时由于反相色谱柱对高亲水性物质检测的局　限，应采用其他色谱系统和其他类型色谱柱，如正相色　谱、离子交换系统、ｃ　和ｃ。色谱柱等，对制备与降解　产生的极性较大的分子、离子进行考查，作为有关物质　研究的一部分。除对已知杂质可采用ＴＬＣ法检测外，　加速试验中，含量下降已经很大，但有关物质却没有明　显增加，提示有关物质的检测方法无法完全检出杂质，　也不能控制贮藏过程中变化较大的杂质。例如某企业　申报的胸腺五肽注射液，加速试验６个月含量下降　２０％以上，有关物质仅由１％增加为３．５％，补充料显　示由于按照国家标准检测有关物质，进样的采集时间　为主峰保留时间的２倍，而２．５倍主峰保留时间时，有　较大的杂质峰出现，并且加速试验中增加明显，而这一　杂质没有计算，有关物质检测存在很大缺陷。　当然，即使采用高效液相色谱法检测含量，存在　１％～２％的误差也是合理的，因此在进行物料平衡考　查时，研究者应该特别注意操作的准确，数据的重现性　以及所使用的对照品质量应保持一致。但是，对于多　数转基因技术制备的多肽，常采用药物效价测定法控　制含量，例如干扰素采用细胞病变抑制法。其效价测　定结果说明活性蛋白的含量，并且，检测结果一般允许　在很大的范围内波动，因此与杂质变化没有直接的对　应关系。同样，生化提取多肽常采用的ｕＶ法和显色　法，由于专属性差，供试品中酪氨酸和色氨酸的含量对　检测结果有很大影响，一般其数据也不用于物料平衡　考查。　应该说明的是，无论ＨＰＬＣ法的含量测定，还是有　关物质检测，都是只能区分多肽一级结构的检测。多　肽的二级结构与溶剂、ｐＨ和温度有密切关系，如果空　间构象改变而形成的非活性肽，其理化性质（如溶解　性）变化不明显，这些检测方法经常是不能区分的。因　此，至少在研制初期，进行效价测定是很有必要的，研　究比较深入后，可以取消生物检测法。例如，初期胰岛　素制剂均采用小鼠血糖检测法计算效价，但目前胰岛　素基本都采用ＨＰＬＣ法控制含量，质量比较稳定。　总之，由于多肽类药物结构的复杂性和不稳定性，　其质量控制风险比较大。同时，作为药物研发的新热　点，其有关物质检测的很多问题都处于探索阶段，例如　杂质检测方法学验证的合理性、免疫原性杂质的检测　与定量等问题，在这种情况下，有时可以采用药理学检　测项目进行补充，比如异常毒性、降压物质等实验都是　天津药学Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｙ　２０１３年第２５卷第１期　经常采用的。　３康健磊，徐冰珠，李建宇，等．关于合成多肽药物中非对映异构体杂质　参考文献　的研究［Ｊ］．中国现代应用药学，２０１０，２７（５）：３８７　１孔英梅，杨伯群．新药有关物质检查中的一些问题［Ｊ］．中国新药杂　４王鹏．合成多肽药物结构确证和质量研究［Ｊ］．中国新药杂志，２００９，　志，２０００，９（７）：４６２　１８（２４）：２３０２　２中国药典［ｓ］．二部．２０１０：附录１９４，附录２０４　ＨＰＬＣ法测定得生片中芍药苷含量　尹静文　，吴贵华　，王杏林　（１．天津医科大学，天津３０００７０；２．天津市药品检验所，天津３００００７０；３．天津药物研究院，天津３００１９３）　摘要目的：建立高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）测定得生片中芍药苷的含量。方法：采用Ａｇｉｌｅｎｔ—Ｃ　。（２５０　ｍｍ×４．６　ｍｍ，５　ｍ）色谱柱；以甲醇一０．１％磷酸缓冲盐（ｐＨ为７．４）（２１：７９）为流动相；检测波长为２３０　ｎｍ。结果：芍药苷在　０．１２０　７８—１．ｏｏ６５　范围内线性良好（ｒ＝０．９９９９），平均回收率为１０１．９％，ＲＳＤ为１．３０％（ｎ＝６）。结论：本方法可用于　得生片的质量控制。　关键词得生片，芍药苷，ＨＰＬＣ　中图分类号：Ｒ９２７．２　文献标识码：Ａ　文章编号：１００６－５６８７（２０１３）０１－．００１１－０３　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐａｅｏｎｉｌｆｏｒｉｎ　ｉｎ　Ｄｅｓｈｅｎｇ　ｔａｂｌｅｔｓ　ｂｙ　ＨＰＬＣ　Ｙｉｎ　Ｊｉｎｇｗｅｎ　。Ｗｕ　Ｇｕｉｈｕａ２，Ｗａｎｇ　Ｘｉｎｇｌｉｎ　（１．Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３０００７０；２．Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｔｗｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３０００７０；３．Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ－Ｔｉａｎｊｉｎ　３００１９３）　ＡＢ　ｓ．眦ＣＴ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａｎ　ＨＰＬＣ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐａｅｏｎｉｆｌｏｒｉｎ　ｉｎ　Ｄｅｓｈｅｎｇ　ｔｂａｌｅｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：　Ａｇｉｌｅｎｔ—Ｃｌ８’（２５０　ｍｍｘ４．６　ｍｍ。５　ｍ）ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ｍｅｔｈｏｌ一０．１％ｐｈｏｓｐｈａｔａ　ｂｕｆｆｅｒ　ｓｏｌ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