RNAi对结肠癌HCT-8细胞桩蛋白表达的沉默作用观察

山东医药２０１０年第５０卷第４２期　ＲＮＡｉ对结肠癌ＨＣＴ　８细胞桩蛋白　表达的沉默作用观察　秦军　，梁海滨　，吴美华　。马利林　，柯靖　，黄宝玉　，樊勇¨　（１南通大学附属医院，江苏南通２２６００１；２百奥迈科生物技术有限公司）　摘要：目的观察ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉ）对结肠癌ＨＣＴ一８细胞桩蛋白（Ｐａｘｉｌｌｉｎ）表达的沉默作用。方法构建针对　Ｐａｘｉｌｌｉｎ基因序列的短发卡ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）表达载体，并转染至结肠癌ＨＣＴ一８细胞，７２　ｈ后分别用实时定量ＰＣＲ和　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法测定转染细胞中ＰａｘｉＵｉｎ　ｍＲＮＡ及蛋白。结果Ｐａｘｉｌｌｉｎ．ｓｈＲＮＡ２、ＰａｘｉＨｉｎ—ｓｈＲＮＡ３、Ｐａｘｉｌｌｉｎ—ｓｈＲＮＡ＿根据针对ＰａｘｉＵｉｎ基因设计了小干扰ＲＮＡ（ｓｉｒｔＮＡ）　序列，构建了ｓｈＲＮＡ表达载体，并成功转染至ＨＣＴ。８细胞。以空白对照组作均一化，转染ＰａｘｉＨｉｎ—ｓｈＲＮＡ一１、　＿ＮＣ的细胞及空白对照组细胞Ｐａｘｉｌｌｉｎ　ｍＲＮＡ相对表达量分别　ＲＮＡｉ可沉默结肠癌ＨＣＴ・８细胞Ｐａｘｉｌｌｉｎ的表达。　为０．６６±０．２８、０．３１±０．１１、１．００±０．２２、１．０５±０．３２、１．００±０．２９，Ｐａｘｉｌｌｉｎ蛋白相对表达量分别为０．６２±０．１ｌ、　０．３９±０．１３、０．７４±０．２１、０．９４±０．０９、１．００±０．１６。结论中图分类号：Ｑ８１２；Ｒ７３５．３　文献标志码：Ａ　关键词：ＲＮＡ干扰；短发卡ＲＮＡ；小干扰ＲＮＡ；结肠癌细胞；桩蛋白　文章编号：１００２－２６６Ｘ（２０１０）４２．００２２—０２　Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｐａｘｉｌｌｉｎ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ　ＨＣＴ・８　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　Ｑｍ　ＪｕｎＬ。ＬＩＡＮＧ　Ｈａｔ—ｂｉｎ，ＷＵ　Ｍｅｉ—ｈｕａ，ＭＡ　Ｌｉ一抚ｎ，ＫＥ　Ｊ订晤，ＨＵＡＮＧ　ｎａｏ－ｙｕ，ＦＡＮ　Ｙｏｎｇ　（１　Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆＮａｎｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｔｏｎｇ　２２６００１，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）ｆｏｒ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｔｈｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｐａｘｉｎｉｎ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ＣＯ］ＯＩｌ　ｃａｎｃｅｒ　ＨＣＴ．８　ｃｅＨｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｅｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ＰａｘｉＨｉｎ　ｓ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｂａｎｋ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ｐａｘｉｌｌｉｎ　ｇｅｎｅ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｓｈｏｒｔ　ｈａｒｐｉｎ　ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ），ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｅｅｔ　ｔｏ　ｈｕｍａｎ　ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ　ＨＣＴ一８　ｃｅＨｓ．Ｔｈｅ　ＰａｘｉＨｉｎ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄ　ｃｅＵｓ　ａｔ　ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｆｏｒ　７２　ｈ　ｂｙ　ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈＲＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｉｒｎｇ　ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ｏｌｌｇｏｎｕｅｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ＨＣＴ．８　ｃｅｌｌｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｓｔｒａｉｎ　ｗｅｒｅ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｐａｘｉ￣ｉｎ—ｓｈＲＮＡ＿ｌ，　ＰａｘｉＨｉｎ—ｓｈＲＮＡ２，ＰａｘｉＨｉｎ—ｓｈＲＮＡ　３，Ｐａｘｉｌｌｉｎ・ｓｈＲＮＡＮＣ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｕｎ—ｔｒｅａｔｅｄ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＰａｘｉＨｉｎ　ｍＲＮＡ　＿ａｆ１ｅｒ　ｔｒａｎｓｆｅｅｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　０．６６±０．２８。０．３１±０．１１，１．Ｏ０±０．２２，１．０５±０．３２，１．Ｏ０±０．２９　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｌｅ　ＰａｘｉＨｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌｓ　ｗｅｒｅ　０．６２　４－０．１１，０．３９±０．１３，０．７４±０．２１，０．９４±０．０９　ａｎｄ　１．００士０．１６．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＲＮＡｉ　ｃａｎ　ｄｅｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｐａｘｉｌｌｉｎ　ｉｎ　ｃｏｌｏｎ　ｃａｎｃｅｒ　ＨＣＴ一８　ｃｅＵｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＲＮＡ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ｓｈ０Ｉｔ　ｈａｒｐｉｎｅ　ＲＮＡ；ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ；ｃｏｌｏｎ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ；Ｐａｘｉｌｌｉｎ　桩蛋白（Ｐａｘｉｌｌｉｎ）是一种黏着斑相关蛋白，序列　方法，定量ｓｈＲＮＡ对Ｐａｘｉｌｌｉｎ在该细胞中ｍＲＮＡ和　高度保守，分布于所有组织和细胞¨　，在信号传导　中起接头蛋白的作用　Ｊ。ＲＮＡ干扰（ＲＮＡｉ）是一种　阻抑基因表达的方法，是由双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）介导　的、特定酶参与的特异性基因沉默技术，在转录水　蛋白表达量的沉默水平，筛选出可以有效沉默结肠　癌ＨＣＴ一８细胞Ｐａｘｉｌｌｉｎ的小干扰ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）。　１材料与方法　１．１质粒、细胞及试剂ｓｈＲＮＡ载体ｐＲＮＡＴ—Ｕ６．１　平、转录后水平和翻译水平上特异性地阻断或降低　相应基因的表达　。２００９年８月～２０１０年４月，我　／Ｎｅｏ。克隆菌株Ｅ．Ｃｏｉｌ　Ｔｏｐｌ０，根据分子克隆ＣａＣｌ　法自制　感受态菌株，其效价＞１０。ｃｆｕ／ｖｇ。结肠癌　们以结肠癌细胞为模型，构建含有几个针对Ｐａｘｉｌｌｉｎ　序列的短发卡ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）表达载体，通过转染结　肠癌细胞ＨＣＴ一８，采用实时定量ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　基金项目：江苏省南通市社会发展科技计划基金资助项目　（￥２００８０２５）。　ＨＣＴ一８细胞。Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶，性酶，Ｔ４　ＤＮＡ　连接酶。质粒回收试剂盒，琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试　剂盒。Ｒａｂｂｉｔ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ｔｏ　ＰａｘｉＵｉｎ，碱性磷酸酶标记　的羊抗兔ＩｇＧ。　１．２　Ｐａｘｉｌｌｉｎ基因ｓｈＲＮＡ序列设计　在Ｇｅｎｅｂａｎｋ　中，Ｐａｘｉｌｌｉｎ基因有３个不同的转录体。采用　・通讯作者　２２　山东医药２０１０年第５Ｏ卷第４２期　ＤＮＡＭＡＮ　６．０序列分析软件，做序列同源性比对分　析，选择Ｐａｘｉｌｌｉｎ基因的３个转录体ｍＲＮＡ序列中的　同源区作为ｓｉＲＮＡ位点设计区域，并在ｓｉＲＮＡ靶位　点设计网站进行ｓｉＲＮＡ序列设计。将软件生成的　ｓｉＲＮＡ序列在ＮＣＢＩ数据库做Ｂｌａｓｔ分析，筛选与人类　其他基因同源性小、针对Ｐａｘｉｌｌｉｎ基因的ｓｉＲＮＡ（用于　构建Ｐａｘｉｌｌｉｎ．ｓｈＲＮＡ—ｌ、Ｐａｘｉｌｌｉｎ—ｓｈＲＮＡ一２、　Ｐａｘｉｌｌｉｎ—ｓｈＲＮＡ＿３寡核苷酸）；同时设计与人类基因同　源性差的无关序列（用于构建Ｐａｘｉｌｌｉｎ—ｓｈＲＮＡ—ＮＣ）作　对照。　１．３　Ｐａｘｉｌｌｉｎ基因ｓｈＲＮＡ表达载体的构建将上　述设计的Ｐａｘｉｌｌｉｎ基因ｓｈＲＮＡ序列进一步设计为寡　核苷酸，每条均为６３个碱基，并在５　端和３　端融合　ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄＩＩＩ酶切位点。每条寡核苷酸含有１９　个位点的正义ｓｉＲＮＡ序列、９个碱基（ｒｌｑ＇ＣＡＡＧＣＧＣ）　的Ｌｏｏｐ结构、ｌ９个碱基的反义ｓｉＲＮＡ序列，末端含　有１ＴＩⅥＷ转录终止位点。送百奥迈科生物技术有　限公司合成寡核苷酸。将上述互补的序列退火，插　人ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄＩｌＩ酶切线性ｓｈＲＮＡ载体，Ｔ４　ＤＮＡ　连接酶４　ｏｃ过夜；转化Ｅ．Ｃｏｉｌ　Ｔｏｐｌ０感受态，挑单克　隆ＰＣＲ菌检分析，进一步测序获得序列完全正确的　ｓｈＲＮＡ表达载体。　１．４　Ｐａｘｉｌｌｉｎ基因ｓｈＲＮＡ表达载体的转染选择生　长状态好、处于对数生长期的ＨＣＴ一８细胞，０．２５％胰　蛋白酶消化成单细胞悬液，计数，调整细胞密度为１．２　×１０　／ｍｌ，接种于６孔板。按照试剂盒说明书进行转　染，分别转染Ｐａｘｉｌｌｉｎ—ｓｈＲＮＡ一１、Ｐａｘｉｌｌｉｎ—ｓｈＲＮＡ一２、　Ｐａｘｉｌｌｉｎ—ｓｈＲＮＡ＿３、Ｐａｘｉｌｌｉｎ—ｓｈＲＮＡ＿ＮＣ，同时设空白对　照组，每组重复３次。　１．５转染细胞总ＲＮＡ提取及Ｐａｘｉｌｌｉｎ　ｍＲＮＡ检测　采用实时定量ＰＣＲ法。ＨＣＴ一８细胞转染后７２　ｈ，　提取细胞总ＲＮＡ。用Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８作为反转录引　物，将１　ｇ总ＲＮＡ反转录成第１链ｃＤＮＡ。以　ｃＤＮＡ为模板，用Ｐａｘｉｌｌｉｎ和ＧＡＰＤＨ特异性引物进　行ＰＣＲ，最后收集荧光信号。做产物熔解曲线分　析，检测产物特异性，用ＡＡＣｔ法进行分析，用内参　照ＧＡＰＤＨ做标准化，得到目的基因Ｐａｘｉｌｌｉｎ的相对　表达量，计算沉默率。　１．６转染细胞总蛋白的提取及Ｐａｘｉｌｌｉｎ蛋白的检测　采用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法。收集细胞，用冰冷的ＰＢＳ洗　２—３次，裂解液裂解。将细胞全蛋白（１０～１５　ｍｇ）进　行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，并转至ＰＶＤＦ膜，封闭液封闭后，　膜用１：５００的兔抗Ｐａｘｉｌｌｉｎ抗体４℃过夜孵育。洗涤　之后，室温下用１：２　０００的碱性磷酸酶标记的羊抗兔　ＩｇＧ孵育１　ｈ，显影。将ｘ线片扫描后，用图像分析软　件分析，用１３一ａｃｔｉｎ做标准化，获得目的蛋白即Ｐａｘｉｌｌｉｎ　蛋白的相对表达水平，计算沉默率。　２　结果　根据ｓｉＲＮＡ序列设计了ｓｈＲＮＡ寡核苷酸序列：　Ｐａｘｉｌｌｉｎ—ｓｈＲＮＡ＿ｌ的靶点序列为ＣＧＡＧＡＧＴＣＴＣＴＴ。　ＧＧＡＴＧＡＡ，Ｐａｘｉｌｌｉｎ—ｓｈＲＮＡ一２为ＧＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴ—　ＴＣＧＡＣＡＴ，Ｐａｘｉｌｌｉｎ—ｓｈＲＮＡ一３为ＣＧＣＡＡＧＧＡＣ—　ＴＡＣＴＹＣＧＡＣＡ，Ｐａｘｉｌｌｉｎ—ｓｈＲＮＡ—ＮＣ为ＴｒＣＴＣ—　ＣＧＡＡＣＧＴＧＴＣＡＣＣＴ。构建了序列完全正确的　ｓｈＲＮＡ表达载体，并成功转染至ＨＣＴ一８细胞。　以空白对照组作均一化，转染Ｐａｘｉｌｌｉｎ—ｓｈＲＮＡ一１、　Ｐａｘｉｌｌｉｎ—ｓｈＲＮＡ２、Ｐａｘｉｌｌｉｎ—ｓｈＲＮＡ３、Ｐａｘｉｌｌｉｎ—ｓｈＲＮＡ　一一—ＮＣ的细胞及空白对照组的Ｐａｘｉｌｌｉｎ　ｍＲＮＡ相对表　达量依次为０．６６±０．２８、０．３１±０．１１、１．Ｏ０±０．２２、　１．０５　４－０．３２、１．Ｏ０　４－０．２９，Ｐａｘｉｌｌｉｎ蛋白相对表达量　依次为０．６２±０．１１、０．３９　４－０．１３、０．７４±０．２１、０．９４　－４０．０９、１．００　４－０．１６，其中Ｐａｘｉｌｌｉｎ—ｓｈＲＮＡ－２的沉默　率最高，其ｍＲＮＡ沉默率为６９％±１１％，其蛋白沉　默率为６１％４－１３％。　３讨论　黏着斑的集合和分解调节着细胞的黏附和运　动，进而影响肿瘤细胞的转移，而这一作用是受　Ｐａｘｉｌｌｉｎ调节的。另外，Ｐａｘｉｌｌｉｎ可与Ｖ．Ｓｒｃ、Ｖ．Ｃｒｋ、　ＢＣＲ．ＡＢＬ等多种癌相关基因结合　’。Ｊ，扰乱、甚至误　导正常黏附和控制细胞增殖所需的生长因子的信号　级联，从而参与肿瘤的发生、侵袭、转移。　本研究利用ＲＮＡｉ技术成功构建了可以特异性　沉默结肠癌细胞中Ｐａｘｉｌｌｉｎ基因的ｓｈＲＮＡ，并将特异　性阻断Ｐａｘｉｌｌｉｎ基因的ｓｈＲＮＡ表达载体导入结肠癌　ＨＣＴ．８细胞，有效下调了该细胞中的Ｐａｘｉｌｌｉｎ　ｍＲＮＡ　及其蛋白表达。ＲＮＡｉ技术与其他阻断基因表达技术　相比，特异性更高，作用更迅速，不良反应小，在有效　沉默靶基因的同时，对细胞本身的系统没有明显　影响。本研究结果为Ｐａｘｉｌｌｉｎ在肿瘤中的作用探讨提　供了分析手段和方法，为进一步研究Ｐａｘｉｌｌｉｎ在肿瘤　转移、浸润中的作用提供了有效而简单的途径。　参考文献：　［１］Ｍａｚａｋｉ　Ｙ，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　Ｓ，Ｓａｂｅ　Ｈ．Ｍｏｎｏｃｙｔｅ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｎｏｖｅｌ　ｐａｘｉｌｌｉｎ　ｉｓｏｆｏｒｍｓ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｔｏ　ｆｏ—　ｃａｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９９７，２７２（１１）：７４３７—　７４４＿４．　［２］Ｂｒｏｗｎ　ＭＣ，Ｔｕｒｎｅｒ　ＣＥ．Ｐａｘｉｌｌｉｎ：ａｄａｐｔｉｎｇ　ｔｏ　ｃｈａｎｇｅ［Ｊ］．Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｒｅｖ，２００４，８４（４）：１３１５—１３３９．　［３］Ｓｈｉ　Ｙ．Ｍａｍｍａｌｉａｎ　ＲＮＡｉ　ｆｏｒ　ｔｈｅ，ｎ￣ｓｅｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ，２００３，　１９（１）：９－１２．　［４　３黄培堂译．分子克隆实验指南［Ｍ］．３版．北京：科学出版杜，　２００２：９６－９９．　［５］Ｍａ　ＰＣ，Ｋｉｊｉｍａ　Ｔ，Ｍａｕｌｉｋ　Ｇ，ｅｔ　ａ１．ｃ—ＭＥＴ　ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ：ｎｏｖｅｌ　ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｒｅｇｕ—　ｌａｔｉｎｇ　ｅｙｔｏｓｋｅｌｅｔｌａ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００３，６３（１９）：６２７２—　６２８１．　［６］Ｍａｕｌｉｋ　Ｇ，Ｋｉｊｉｍａ　Ｔ，Ｍａ　ＰＣ，ｅｔ　ａ１．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃ—Ｍｅｔ／ｈｅｐａ—　ｔｏｃｙｔｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　ｓｍａｌｌ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ［ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ。２００３，６３（１９）：６２７２—６２８１．（收稿１３期：２０１０—０８—０２）　２３